第一章口蹄疫病毒
Foot-and-Mouth Disease Virus
Encarnacion Martinez-Salas,Margarita Saiz，Francisco Sobrino摘要
口蹄疫病毒Foot-and-mouth disease virus,FMDV是小核糖核酸病毒科口疮病毒属（又称为口蹄疫病毒属）的典型代表性成员，这种小核糖核酸病毒是一种能在全球范围内导致牛发生急性系统性水疱病的病原体。在此，我们阐述了一些与这种高变异性和高传染性病毒有关的分子生物学方面的问题，并重点描述了病毒的基因组构成以及基因的表达控制机制，这些有助于了解该病毒的感染周期。感染后，构成病毒基因组的单链正义RNA不依赖于帽子结构而是通过内部核糖体进入位点（IRES）很快进入高效率翻译期，在此过程中病毒蛋白酶的表达抑制了细胞蛋白质的合成。在翻译过程中，由病毒自身编码的蛋白酶同步加工处理生成的多聚蛋白，从而释放出不同的成熟蛋白。病毒RNA和蛋白质与宿主细胞的不同成分相互作用是导致病毒致病的关键因素。若想有效防控口蹄疫病毒致病以及疫病蔓延，需要深入了解病毒感染周期的分子机制。
FMDV是口蹄疫Foot-and-mouth disease，FMD）的致病原。FMD是传染性最高的最重要的家畜疫病之一，引起急性系统性水疱病，在世界范围内流行，被国际兽医局（OIE）列为A类动物传染病之首Sobrino et al,2001。FMDV只感染偶蹄动物，主要是牛、猪、绵羊、山羊Thomson et al,2003。在口蹄疫流行地区，通过常规疫苗免疫控制口蹄疫，而无口蹄疫国家则是通过采取严格限制源自口蹄疫疫区的动物及其相关制品的流通和贸易手段防控口蹄疫Sutmoller et al,2003。从分类学上划分，FMDV属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属。一些小RNA病毒能够导致人类重大疾病的发生，例如隶属该科的在分子水平上研究最广泛的脊髓灰质炎病毒。FMDV具有很强的基因和抗原变异能力，根据诱导动物交叉保护能力的不同，将其分为7个血清型，即A、O、C、Asia1（亚洲1型）、SAT 1（南非1型）、SAT 2（南非2型）和 SAT 3（南非3型）。Domingo以及其合作者以FMDV作为模型研究RNA病毒的遗传变异性（Domingo et al,1992。这些早期研究结果为研究RNA病毒群体的准种结构特征提供了有益信息，有助于了解其生物学特性。在早期进化阶段，地球上大分子复制时会出现的一系列相关但不相同核酸分子，准种概念最初就是基于这样的理论基础提出来。准种概念首次在噬菌体Q群体上得到了实验性证实，继而RNA病毒特征也证实了准种的存在，因为RNA病毒是由众多的变异体（准种）组成，在保持高突变率和选择压力下的竞争适应之间保持一种复杂的动态平衡。关于FMDV生物学的这些方面的讨论超出了本章的范围，感兴趣的读者可以去查看这些更详细的内容Domingo et al,2006；2004；2001。FMDV可以有效感染几种原代细胞和一些传代细胞系，例如BHK-21和IBRS-2。腹腔接种FMDV会导致乳鼠死亡，该方法已经被用于测定病毒滴度。将体外转录的RNA直接接种给小鼠可以拯救细胞培养无法生长的病毒，使其恢复感染性Baranowski et al,2003。经过连续传代后，FMDV能够适应在豚鼠内繁殖。豚鼠是FMDV的模式动物，已经用于病毒的免疫学和嗜性分析Francis et al,1987；Nunez et al,2001。FMDV可以在培养的细胞建立起可持续性感染。在细胞传代过程中，病毒（相对于亲本细胞BHK-21而言，病毒毒力有所增强）和细胞（对原代病毒的抵抗力越来越强）发生了共进化de laTorre et al,1988。在过去几年里，一些关于病毒感染周期的分子机制及其对病毒毒力、嗜性、和疾病防控方面影响的相关信息已经逐渐被揭晓。当前，FMDV仍然是一个巨大的威胁，还需要进一步的研究，去阐明与病毒致病性和疾病预防有关的分子机制。基因组结构与所有的小核糖核酸病毒一样，FMDV基因组为正义RNA，全长大约为8 500个核苷酸（nt）（图11）。FMDV单拷贝基因组包裹在由4种结构蛋白即VP4（1A）、VP3（1C）、VP2（1B）和 VP1（1D）各60个拷贝组成的蛋白衣壳内。病毒RNA含有一个开放阅读框（open reading frame,ORF），两侧翼为含有顺式作用元件的非编码区（non-coding regions,NCRs），参与病毒复制和基因表达（图11）。RNA的3端被多腺苷酸化，形成了PolyA尾巴。与大部分细胞mRNAs相比较，FMDV基因组在5端没有帽子结构，但是由病毒自身编码的小蛋白，VPg 3B，共价偶联到5末端。病毒RNA具有感染性de la Torre et al,1987，利用该特征可以构建出感染性cDNA克隆 Zibert et al,1990，这是研究病毒基因产物功能和RNA模体（motifs）的有用工具。病毒基因组携带有全部信息，能够取代宿主机能、关闭细胞蛋白质合成、仅允许病毒自身RNA和蛋白质在感染细胞内生成 Belsham and Martnez-Salas,2004。病毒复制的整个周期都是在细胞质内完成的。病毒RNA被翻译成多聚蛋白，在翻译的同时，病毒蛋白酶 Lpro 和 3Cpro将聚蛋白加工处理为成熟的蛋白产物（图11）。在这些产物中，RNA依赖性RNA聚合酶3Dpol能够以正链RNA为模板生成负链RNA，再以此负链RNA作为模板链合成正链RNA。生成的一些正链RNA被包裹入病毒衣壳中组装成新的感染性病毒粒子。图11FMDV基因组示意图
图11中注明了FMDV RNA相关结构域以及聚蛋白裂解后的成熟病毒蛋白，详细信息请参阅下面文本内容。病毒基因组5端结构及功能FMDV 基因组5端非编码区（5NCR）长约1 300nt，包含有病毒复制和翻译起始所需的核酸序列。当我们研究分析此序列时发现了一些结构和功能元件。在RNA的5末端有一段长约360个碱基左右的核苷酸序列，被命名为S片段，据推测该片段形成了一个大的发卡结构（图11）。采用oligo（dG）和RNase H处理病毒RNA后产生两个片段，其中较小的一个是S片段。研究表明FMDV的S片段负责与核酸3端发生RNARNA相互作用Serrano et al,2006。采用S-RNA标记探针和细胞蛋白抽提物进行紫外交联实验，结果表明，p116和p47两种细胞因子，推测可能是polyrC结合蛋白PCBP与S片段发生相互作用。脊髓灰质炎病毒PV的5端也有类似元件，尽管二级结构不同，但已证明它能与一些病毒蛋白（3CD前体）和细胞蛋白PCBP2发生相互作用Gamarnik and Andino,1997；Parsley et al,1997。PolyA结合蛋白PABP可以与PCBP及3端的PolyA发生相互作用。一些学者认为这些相互作用在从翻译到复制的转变过程中起着重要作用。病毒RNA在由衔接5端和3端的蛋白桥作用下会发生环化，在此过程中，这种相互作用也会发挥作用Gamarnik and Andino,1998；Herold and Andino,2001。在5端的S片段之后是多聚胞苷酸polyC片段（图11中Cn标识），polyC片段是小核糖核酸病毒科大部分心病毒属病毒的共有特性。polyC片段的长度从80～400nt不等，在FMDV田间分离株中一般都是200nt左右 Brown,1972；Harris and Brown,1977。关于polyC长度对感染力的影响还不太清楚，研究结果也不一致，引发了争议。在polyC的下游有一段长约250nt的序列，推测包含多个假结，2～4个不等，数量与不同的分离株有关Escarmis et al,1995。有趣的是，在心病毒属中，假结被推测位于polyC的5端一侧，这意味着假结和polyC片段具有一些相同的功能。如上文所述，小核糖核酸病毒需要5端和3端结构指导RNA依赖性的RNA聚合酶3Dpol识别病毒基因组。在过去的几年里，有证据表明肠病毒、鼻病毒和心病毒的复制都需要内部RNA序列 McKnight and Lemon,1998；Goodfellow et al,2000；Gerber et al,2001。此段序列被称为顺式复制元件cis-acting replication elementcre，包含一个保守基序AAACA，位于一个稳定的茎环结构末端的环内。人类鼻病毒 HRV-14、HRV-2、心病毒以及PV的Cre元件分别位于1D、2A、1B和2C区域内。去除Cre元件不会导致功能丧失。现已证明，在病毒RNA聚合酶的作用下，PV 和HRV-2 的cre序列在VPg 3B尿苷酰化中起到模板作用 Paul et al,2000；Gerber et al,2001。此反应是随着UMP分子共价结合到位于VPg末端的酪氨酸羟基上开始的，产生了VPgpU 和或 VPgpUp，作为RNA合成的引物。该过程被认为是PV RNA复制的关键步骤。已有相关研究结果表明在FMDV基因组的5 NCR存在cre结构，就位于IRES的上游Mason et al,2002图11。Cre包含AAACA基序，将野生型cre插入3NCR能够使cre缺陷型的RNA转录本恢复复制能力。此发现与以前的研究结果相符，缺失94%P1编码区的FMDV突变株仍然可以有效复制McInerney et al,2000。基因组非编码区存在cre元件是FMDV的一个特征性结构，这表明小核糖核酸病毒科病毒在复制阶段采用了不同的复制方式。此外，有报道发现存在一种ts FMDV RNA突变体，这种突变体在保守的茎环结构区有一个不稳定性的变异。这种变异可以通过另外一种在基因组其他区域有缺失的ts FMDV RNAs进行反式互补Tiley et al， 2003。因此，建议cre应该被重新命名为3B-尿苷酰化位点。IRES（内部核糖体进入位点）位于Cre元件下游，与Cre有部分重叠。所有的小核糖核酸病毒都有IRES，它是一种复杂的高度结构化原件，长约450nt，负责病毒RNA上蛋白质合成的内部非帽子结构的起始。FMDV内部核糖体进入位点：蛋白合成控制进入细胞后，病毒RNA的释放和翻译是病毒复制周期的第一步。与所有的核糖核酸病毒一样，由于某些因素FMDV 基因组的5端非编码区（5NCR）的基因结构与扫描模式不太兼容。首先，基因组的5端有一个病毒编码蛋白VPg，共价偶联于末端核苷酸上。其次，5NCR的长度从700～1 300nt不等，含有一些独特的高度结构化的区域。最后，非帽子结构的5NCR有超过10个的AUG密码子不能作为起始密码子。FMDV病毒RNA编码的蛋白质合成是由IRES元件驱动起始的Martinez-Salas et al,2001。在转染细胞和网状细胞裂解液中，FMDV基因组的IRES可以有效驱动其下游第二个顺反子合成蛋白质Martinez-Salas,1999。对于大多数依赖于帽状结构的细胞mRNAs来说，IRES介导了另外一种翻译起始形式。真核生物mRNA5端有一个能够被翻译起始因子eIF4F所识别的m7GpppN帽状结构。该翻译起始因子由3个多肽、帽子结合蛋白eIF4E、RNA解旋酶eIF4A和脚架蛋白eIF4G组成。脚架蛋白eIF4G含有其他蛋白的结合位点，例如eIF3、polyA结合蛋白PABP和Mnk-1（eIF4E激酶）。起始翻译时，小核糖体亚基与结合在5端帽子的eIF4F复合物结构相互作用，并沿着5NCR移动，直至在合适的位置遇到AUG密码子Kozak,1989。在翻译扫描过程中，复杂的RNA结构和上游存在的AUG密码子会抑制小核糖体亚基识别正确的起始密码子。相比之下，由IRES元件介导的翻译起始会直接将翻译组件募集到mRNA分子的某一位置。依赖IRES的蛋白合成机制不受那些抑制帽依赖性翻译起始的一些因素限制。此种抑制情况往往发生在小核糖核酸病毒感染过程中由蛋白酶LFMDV或2A（脊髓灰质炎病毒、鼻病毒）诱导的eIF4G因子被切割之后，或者在脑心肌炎病毒（EMCV）感染细胞时翻译阻遏因子4E-BP1发生了脱磷酸化Martinez-Salas et al,2001之后导致的。对双顺反子采用删除突变体作图法确定小核糖核酸病毒IRES大小，结果表明大约450nt足以启动5末端非依赖性的翻译起始Pelletier and Sonenberg,1988。比较不同的小核糖核酸病毒IRES序列，结果表明仅是一些小枝杈序列比较保守。根据预测的RNA二级结构模型确定小核糖核酸病毒IRES结构有2种类型，I型包括肠病毒鼻病毒，Ⅱ型包含心病毒和口蹄疫病毒。甲型肝炎病毒是III型IRES的代表，最近报道的四型小核糖核酸病毒IRES与丙型肝炎病毒HCV 有很多相似之处Pisarev et al,2004。小核糖核酸病毒IRES之间缺乏结构保守性反映出这些IRES元件是采用多种方式与翻译组件发生相互作用。IRES结构与功能的关系通过采用分析RNA结构、基因突变和解析基因系统进化保守性的综合方法，详细研究了FMDV RNA结构中与IRES活性有关的基因结构。尽管RNA病毒是高度变异的，但是基本元件是非常保守的Martinez-Salas and Fernandez-Miragall,2004。核苷酸的共变异性代表二级结构或三级结构的稳定性，这可能与介入IRES活性有关。在RNA的环状区域或非结构区常常会出现独立的非依赖性变异。在内部翻译起始中，那些固定不变的基因区域就是一些与IRES活性有关感兴趣区。如图12所示，FMDV的IRES有5个结构域。区域1的残基就是cre茎环结构的右臂Mason et al,2002。预测区域2形成了一个稳定的茎环结构，在环的顶端有一个富含嘧啶的序列区。此茎环在EMCV中也是保守的，包含多聚嘧啶序列结合蛋白的主要结合位点Luz and Beck,1991。区域3是FMDV IRES的中心区，根据二级结构分析，区域3含有两个特殊结构（图12）。通过由化学方法及核糖核酸酶介导的RNA结构分析表明，顶环部分包含一个稳定的茎环结构，形成一个四通接头（Fernandez-Miragall and Martinez-Salas,2003。顶环上有两种保守的基序GUAA和AAAA，这些基序的突变分析结果表明，它们是负责IRES活性的重要区域 Lopez de Quinto and Martinez-Salas,1997。替换FMDV IRES的GUAA的核苷酸，发现GNRA基序是保持IRES活性达到100%所必需的序列。对EMCV IRES同等位子的GNRA研究分析表明，该基序对翻译起始也有类似的功能Robertson et al.,1999。GNRA基序以发卡结构将相邻的茎环衔接起来Fernandez-Miragall and Martinez-Salas,2003。用G取代基序第4位碱基A会导致RNA发生重组，会使区域3二级结构上一些碱基发生远离。与含有GUAA序列的亲本RNA比较，携带有UNGG 和GUAG序列的突变体，在受到针对特定核苷酸的化学法处理后，会丧失对化学试剂破坏的保护作用，这表明GNRA基序控制着区域3的结构和稳定性。GNRA基序的这种作用可能受其与远距离含有保守性CACG序列的区域相互作用调控Fernandez-Miragall et al.,2006。有报道显示作为核糖核酸酶P反应底物的结构元件与中央结构域，即区域3，顶端的序列发生了重叠 Serrano et al.,2007。因此，IRES区域可能有一个潜在的类似tRNA信号的结构。GNRA发夹结构是结构化RNA分子中一种常见的基础构件Doherty et al,2001。因而，IRES中的这些基序的作用可能是相似的。通过凝胶迁移率分析推测，FMDV IRES的中心区域（即是区域3）与其他结构域，自身序列乃至整个IRES发生了独特的相互作用Ramos and Martinez-Salas,1999。这些结果表明，区域3可能是作为一个支架结构，将IRES的所有区域有机地结合起来。此外，区域3强大的二聚化能力决定了与其他IRES分子间的相互作用，这与报道的IRES元件缺陷型FMDV的补充数据结果相一致Drew and Belsham,1994。与PV IRES元件中的相对应的基序一样，位于中心区（即区域3）具有保守性的富含C的环状序列（C-rich loop对于碱基替换不是很敏感Gamarnik et al.,2000。富C环是与polyrC结合蛋白发生相互作用的一个候选基因序列（Stassinopoulos 和Belsham,2001。然而，PCBP2与EMCV 或FMDV的 5NCR的结合不是IRES活化所必需的，这与FMDV富C环的功能分析结果相一致。中心区域（区域3）的近端有一个被内部凸起断开的长茎状结构Fernandez-Miragall et al.,2006。碱基突变结果表明，区域3基底序列第二个碱基是形成螺旋二级结构所必需的Martinez-Salas et al,1996。根据对区域3基底序列的分析推测，此部分结构元件可能起到稳定整个区域3的作用。根据之前的报道，在口疮病毒属和心病毒属，其IRES中都有保守的一级和二级结构。在不同的FMDV田间分离株的IRES区域4的基底部都发现存在两个二级结构上保守的富含A的内部凸环（图12）。相比于其他基序的碱基，仅A312一个碱基突变为U就将会严重破坏IRES的活性Lopez de Quinto and Martinez-Salas,2000。在感染细胞内，一些损坏IRES预测的二级结构的突变会破坏IRES活性。但是，若被损坏的二级结构恢复后，IRES的活性随后也会完全恢复，这表明IRES发挥内部翻译起始活性需要一些位置中某些碱基对的存在。对不同的FMDV分离株进行序列比较分析，结果表明在区域5存在一个保守的发卡结构 Lopez de Quinto et al,2001，在EMCV的IRES元件中也有此结构。然而，对区域5某些保守碱基进行置换，其对FMDV IRES活性的破坏程度远远低于对区域4的富含A凸起A-bulge或区域3的GNRA环进行突变所造成的影响。图12FMDV IRES的二级结构通过以酶学和化学为基础的RNA结构分析法描述了系统的保守性。灰色的方框里描述了数据库中注册的FMDV田间分离株的共突变的核苷酸。IRES可分为1～5个区域，画线部分代表功能性起始密码子AUG。右框是起始因子结合位点和能够与FMDV IRES发生相互作用的辅助蛋白示意图。
IRES与蛋白的相互作用在FMDV依赖于IRES的翻译起始过程中，细胞蛋白起着重要的作用（图12，右端）。用EMCV或者FMDV IRES元件进行重组40S核糖体分析表明，形成48S起始复合物需要典型的eIF4A、eIF4G、eIF2和eIF3起始因子Kolupaeva et al,1998;Pilipenko et al,2000。eIF4G与EMCV和FMDV IRES发生相互作用，采用蛋白酶消化处理后，其暴露的C端含有与eIF3和eIF4A相结合的位点。与该说法相一致的是，在FMDV的L蛋白切割eIF4G后，由这些元件推动的内部翻译起始过程可以高效率进行Martinez-Salas et al,1993;Belsham and Brangwyn,1990;Ohlmann et al,1996。
对与区域4相对应的转录本进行紫外交联分析，结果表明，区域4与eIF4G的结合效率与全长IRES的结合效率相同，这表明FMDV IRES识别eIF4G蛋白不再需要其他位点Lopez de Quinto and Martinez-Salas,2000。此外，在转染FMDV Lb蛋白酶的细胞内，存在eIF4GI和eIF4GI两种处理后形式，它们与FMDV IRES的结合效率与未经过处理的eIF4G相一样Lopez de Quinto et al.,2001。损坏区域4基底部保守的结构基因序列会破坏eIF4G-IRES的相互作用。eIF4G-IRES间强的相互作用关系和转染细胞内IRES的活性表明，与eIF4G结合是病毒在细胞体内启动翻译机制的关键一步。支持此结论的其他实验表明，利用与FMDV IRES 3末端相对应的转录本去耗尽网状细胞的裂解物，会导致依赖于帽子结构的翻译过程中所需因子大量减少Stassinopoulos and Belsham,2001。紫外交联分析表明，FMDV IRES的区域5与eIF4B发生了强相互作用Lopez de Quinto et al.,2001。破坏与eIF4B结合的碱基突变会使IRES的活性降低70%～80%。同样，与eIF4B的结合刺激可以使EMCV IRES的48S复合物的形成效率增加2倍Pestova et al.,1996。有着同样二级结构的相关IRES元件在RNA蛋白发生功能性相互作用方面是不同的。与心病毒属病毒IRES相比，在体外48S复合物形成过程中，FMDV IRES需要结合到PTB和增殖相关因子，ITAF45上Pilipenko et al,2000。很多能够与IRES发生相互作用的蛋白上含有几个RNA结合位点，表现出与IRES分子的多位点相互作用模式Hunt et al,1999；Walter et al,1999；Song et al,2005，因此，这些蛋白很可能是RNA的分子伴侣，指导或帮助稳定IRES折叠形成有活性的三级构象。近年来，结合RNA色谱和质谱分析方法确定了一些新的能与IRES相互作用的因子。弄清楚这些因子在内部翻译起始过程中的作用，除了能解释IRES特异性作用之外，还有助于建立IRES的功能模型Reigadas et al,2005。FMDV 3NCR以polyA非依赖性模式激发IRES活性Lopez de Quinto et al,2002。FMDV 5和3NCR间的RNARNA直接相互作用以及RNA蛋白质桥联在一起的现象与病毒末端发生功能性环化完全相吻合。IRES蛋白相互作用：在组织嗜性及病毒致病性中的作用一些不能够作为标准翻译起始因子的蛋白质被发现能与小核糖核酸病毒的IRES发生相互作用，表明这些蛋白可能参与由IRES介导的细胞类别特异性。此外，像在发现的脊髓灰质炎病毒的神经毒性一样，在感染的组织内，病毒IRES可能在调控病原致病性方面发挥重要作用。PTB的一种新构型好像在泰勒氏病毒的神经毒性方面起着重要作用Pilipenko et al.,2001。因此，由于小鼠中枢神经系统运动神经元内有nPTB，所以，泰勒氏病毒的GDVⅡ强毒株能够在鼠中枢神经系统进行增殖。然而，细胞特异性因子能否通过促进IRES的构象转化而使48S复合物转移到特定的起始密码子位点上仍旧是一个悬而未决的问题。尽管已经明确了FMDV IRES在形成起始复合物过程中需要ITAF45，但是产生组织嗜性是否需要其他因子的参与仍不清楚。蛋白合成起始密码子的选择病毒基因组有两个符合阅读框的AUG密码子，两者相隔84个碱基图12 Sangar et al.,1987。到目前为止，为什么在所有FMDV分离株中都有两个保守的蛋白合成起始位点的原因仍不清楚。两个AUG起始位点会导致合成两种形式的前导蛋白，即Lab和Lb（图11），它们仅是在N端有所不同。Lab起始密码子不是病毒生存所必需的，但是突变Lb起始密码子对病毒来说是致命的Cao et al.,1995。在病毒感染的细胞内和双顺反子表达载体都可以合成出两种形式的L蛋白Lopez de Quinto and Martinez-Salas,1999。为了揭示FMDV两个起始密码子的识别机制，将含有FMDV两个起始密码子的RNA转录本与一个报告基团重组，转染细胞后，进行表达分析Belsham,1992。在所有情况下，Lb蛋白起始位点会被优先识别。按着阅读框顺序在两个原始起始密码子之间额外插入2个AUG密码子，结果4个AUG密码子都能被识别。该结果表明，FMDV IRES引导核糖体与Lab起始位置的上游基因相结合。对FMDV第一个起始位点的识别率很低，可能与病毒RNA第一个AUG周围序列为非最优识别序列有关。通过修饰Lab起始位点周围的序列来提高该位点作为翻译起始点的识别率，可以提升该位点的翻译效率，但是令人吃惊的是，这对Lb起始位点的翻译起始效率没有明显的影响Lopede Quinto and Martinez-Salas,1999。因此，这表明这两个起始密码子是各自独立运行的。该论点也得到了其他实验结果的支持。将反义寡核苷酸与Lab起始位点结合后，会阻断此位点的翻译起始功能，而对Lb位点的翻译起始几乎没有影响。因此，FMDV IRES可能引导核糖体结合到Lab起始位点的下游，或者这些核糖体在与第一个起始位点上游序列结合后，立刻就通过一种未知机制转移到第二个起始位点上。病毒多聚蛋白FMDV ORF编码一个由2 330个氨基酸组成的多聚蛋白，一旦合成就被病毒自身编码的蛋白酶Lpro 和3Cpro裂解掉，所以几乎检测不到该多聚蛋白。该多聚蛋白最终裂解为15种成熟产物（图11）。L区包含两个彼此重叠的蛋白，即Lab和Lb，这是由于编码区存在两个具有翻译起始功能的AUG导致产生的。L蛋白酶是类木瓜半胱氨酸蛋白酶中的一种Guarne et al,1998。FMDV Lab和Lb都能从 LP1结合处切割聚蛋白 Medina et al,1993，也能裂解翻译起始因子 eIF4GDevaney et al,1988。只需少量的L蛋白酶即可切割eIF4G，在感染1小时后即可观察到Belsham and Sonenberg,2000。与在感染细胞内裂解 eIF4G相比较，体外切割 eIF4G需要高浓度的重组Lb蛋白酶Kirchweger et al,1994；Gradi et al,2004。虽然L蛋白酶不是病毒存活所必需的Piccone et al,1995,但是它的表达能够抑制具有锁定宿主天然免疫反应功能的-干扰mRNA的反应de Los Santos et al.,2006。最近，已经报道了在FMDV感染的细胞中，宿主因子PTB,PABP和eIF3a、b被裂解的现象Rodrguez-Pulido et al,2007。尽管PABP的裂解至少有一部分是由Lb蛋白酶切割导致的，但是3C蛋白酶参与这些宿主因子的裂解仍不清楚。切除Lpro后，P1-2A前体的N端就会发生酰基化反应。P1-2A前体编码构成病毒衣壳的结构蛋白VP1 1D、VP2 1B、VP3 1C 和VP4 1A（图11）。在3C蛋白酶作用下，FMDV的P1-2A前体被裂解为1AB、1C和1D。在RNA基因组包裹入衣壳的时候，1AB裂解为1AVP4和1BVP2。VP4的酰基化对FMDV病毒粒子的组装或稳定性都有重要作用。在多聚蛋白合成过程中，由16个氨基酸组成的多肽2A起到抑制在2A2B结合处形成肽键的作用。FMDV RNA基因组的P2和P3编码非结构蛋白，经过3Cpro 裂解处理后，能够产生6种不同的成熟非结构蛋白（图11）。每一种非结构蛋白和一些裂解产生的中间体都参与病毒在感染细胞的增殖周期。目前，对2B和2C蛋白了解的还较少。在PV感染细胞内，P2蛋白被发现存在于膜相关的病毒复制复合体中。据了解，2B蛋白中包含一些疏水性区域van Kuppeveld et al,1996，与细胞的通透性和蛋白分泌有关Van kuppeveld et al,1997；Doedens and Kirkegaard,1995。小核糖核酸病毒的2C蛋白上有解旋酶序列，但是其功能从未被报道过。对2C进行突变，可以对能够抑制病毒RNA复制的胍类化合物产生抵抗性Saunders and King,1982。在脊髓灰质炎病毒中，3A蛋白被视为是小核糖核酸病毒复制复合物的膜锚定蛋白，与病毒诱导产生的膜囊泡有关，促进细胞病变发生，抑制蛋白分泌。改变FMDV的3A蛋白，会降低病毒对牛和豚鼠的感染力Nunez et al,2001。VPg3B参与小核糖核酸病毒RNA合成的起始过程，FMDV是唯一一个含有3个不相同的3B蛋白串联在一起的小核糖核酸病毒。虽然可以从携带有单拷贝VPg的感染性RNA中拯救出活病毒，但病毒的感染力与RNA中VPg的拷贝数有关 Falk et al,1992。在体外通过FMDV复制酶3Dpol对每个独特的3B多肽进行尿苷酰化所需的成分不同于PV复制的过程。此尿苷酰化过程严格地依赖FMDV的3CD、cre以及3Dpol，但是polyA尾巴不参与此反应过程Nayak et al,2006。FMDV 3C蛋白酶属于类胰蛋白酶家族中的丝氨酸蛋白酶，负责多聚蛋白的大部分切割工作。目前已经确认了FMDV 3C蛋白酶的主要催化氨基酸残基位点，并解析了其晶体结构Birtley et al,2005；Grubman et al,1995。不像PV的3C，FMDV的3C不需要3D序列参与其加工活性，而且它的表达对细胞具有毒性作用Martinez-Salas and Domingo,1995。FMDV 3C 除了能切割病毒的多聚蛋白外，还可以修饰几种细胞蛋白Falk et al,1990；Li et al,2001。3C蛋白酶还能在L蛋白酶切割eIF4GI后形成位点的C端侧继续切割该因子Belsham et al,2000；Strong and Belsham,2004。这与采用缺乏前导序列的FMDV感染细胞后，eIF4GI生成减少的现象相一致。3Cpro还诱导组蛋白H3和一些宿主因子发生蛋白水解，这可能与被病毒感染的细胞发生转录抑制有关。3D蛋白是病毒的RNA依赖性RNA聚合酶Martinez-Salas et al,1985。3Dpol能够识别不同序列或不同结构的正链或负链RNA的3端并与其发生相互作用，这些过程背后的作用机制仍待进一步去探索。在10个寡腺苷酸残基缺失或存在的条件下，由FMDV 3Dpol、VPg、底物UTP以及二价阳离子形成的复合物，其X-射线结构最近已经被解析Ferrer-Orta et al,2006a。在两种复合物中，VPg嵌入了聚合酶编码RNA的结合缝处。在寡腺苷酸存在条件下形成的复合物是VPg发生尿腺苷酸化VPg-UMP的一种产物。两种金属离子、聚合酶活性位点被催化的天冬氨酸以及基序F碱性氨基酸残基已被确认参与活化反应。与其他病毒RNA复制酶一样，通过手指与拇指状亚结构的互连，FMDV的3Dpol形成一个握拳状构象Ferrer-Orta et al,2006b。病毒3端（结构和功能）FMDV3非编码区（3NCR）由约100nt组成，推测形成两个茎环结构，即SLⅠ和SLⅡ图11 Serrano et al,2006，紧接着是一个由病毒基因编码的polyA尾巴。越来越多的试验资料表明此区域与病毒复制周期密切相关。因此，缺失3NCR的FMDV感染性克隆株丧失了病毒的复制能力。采用其他猪小核糖核酸病毒或者猪水疱病毒SVDV的相应序列取代FMDV 3NCR也不能回复病毒的感染性 Saiz et al,2001。之前有报告也显示，完全缺失3NCR的PV RNA病毒具有生存活性，但是在繁殖力方面存在明显的缺陷Todd et al,1997；Mellits et al,1998；Brown et al.,2005。心病毒属RNA在3NCR有三种茎环结构，其中每一个茎环对病毒的存活力都是至关重要的Duque and Palmenberg,2001。一些细胞蛋白，例如已经被证实的poly（A）结合蛋白（PABP 和 PCBP，能够与FMDV 3NCR发生相互作用Serrano et al,2006。通过双顺反子结构进行的转染实验已经证明，FMDV 3NCR发挥调控病毒的复制和翻译的双重作用Lopez de Quinto et al.，2002。FMDV 3NCR可以促进IRES依赖性翻译，此作用不依赖于由polyA尾巴发挥的促进作用，并且在Lb病毒蛋白酶表达时达到最高水平。如上所述，FMDV的3NCR与5NCR发生了远程的RNARNA相互作用Serrano et al,2006。这些相互作用涉及5NCR的两个不同元件，即S片段和IRES。这两个元件与3NCR发生相互作用时所需条件是不同的。去掉3NCR的SLⅠ或者SLⅡ任何一个结构后,5NCR的S片段与3NCR（S-3NCR）的相互作用仍然能够发生，然而IRES-3NCR的相互作用则需要由完整序列构成的高级结构。相反，polyA不是IRES-3NCR相互作用的必需结构，但是对于S-3NCR的互作则是必需的，这也表明了病毒RNA3端对依赖polyA形成构象的相关性。尽管这些相互作用在病毒增殖周期中的作用仍需进一步研究，但是这与针对PV和其他正链RNA病毒提出的由一些蛋白参与的53RNA桥联模型相一致Herold and Andino,2001；Isken et al,2004；Vende et al,2000，尤其与最近报道的黄病毒属基因组直接发生环化的现象更为符合Alvarez et al,2005；Filomatori et al.,2006。PV的RNA发生环化被认为是通过与3poly（A）相结合的PAPB蛋白和结合于基因组5端的PCBPs蛋白发生相互作用实现的。Herold and Andino,2001。PABP是一种多功能蛋白，同其他蛋白一起与翻译起始因子eIF4G和polyrC结合蛋白2发生相互作用。紫外UV交联分析表明，PABP能够识别FMDV 3UTR，而PCBP以竞争的方式与5端的S片段和3UTR发生相互作用Serrano et al,2006。因此，这些相互作用可能促使RNA发生了环化。病毒粒子：结构与特性一经切割，P1前体蛋白裂解为VP0（包括VP2和VP4）、VP1和VP3，这些裂解的蛋白组装成非对称的聚合物原体。5个聚合物原体又组成了五聚体，12个五聚体又组装成蛋白衣壳，新合成的RNA分子被裹入蛋白衣壳内即组装了一个新的病毒粒子。在RNA包裹入衣壳后，VP0随即自我催化裂解产生了VP2和VP4。由于能够从纯化的病毒中获得高质量的结晶体，所以解析了FMDV病毒粒子的三维结构。采用X射线晶体技术对FMDV的O、A、C血清型病毒粒子进行结构分析，发现这些病毒表现出了小核糖核酸病毒家族普遍存在的主要结构特性Ferrer-Orta,2004。这些病毒粒子由无囊膜的二十面体衣壳组成，直径为28～30nm，VP1、VP2和VP3蛋白位于衣壳表面，而VP4在衣壳内部，N端还有一个十四酸Chow et al,1987。与大部分小核糖核酸病毒不同的是，FMDV衣壳表面较为光滑，在VP1上有一个凸起的G-H环。G-H环由140～160位的20个氨基酸残基组成，在不明显地改变其他衣壳蛋白的情况下，可以变换成不同的构象形式。G-H这个大环有一个高度保守的由精氨酸R-甘氨酸G-天冬氨酸D残基组成的RGD三联体序列。RGD序列是细胞的一个识别位点，呈现在各种细胞外蛋白上，介入与细胞表面整合素受体发生相互作用Fox et al,1989。展示在衣壳表面的氨基酸残基形成了B细胞抗原表位Acharya et al,1989。根据采用跨越VP1上140～160氨基酸残基的几条多肽免疫动物制备的免疫原性模型可以推断出，在VP1蛋白的G-H环上有一个主要的连续性中和性抗原位点（表位A）Bittle et al,1982；Pfaff et al,1982。对于C型口蹄疫病毒而言，G-H环上的抗原结构比较复杂。根据该区域不同肽段对一组中和性单克隆抗体（MAbs）的不同反应能力进行作图分析，可以确定在该区域存在不同的彼此重叠的表位Mateu,1995。因此，G-H环既与FMDV的抗原性有关又参与病毒与宿主细胞的相互作用。通过分析病毒抗单克隆抗体的中和能力具有抗单克隆抗体中和能力的病毒被命名为MAR突变体,发现了存在其他的能够诱导中和抗体产生的抗原表位Mateu,2004。在A型和C型FMDV中，表位C点位于VP1的C端，具有连续性，与G-H环无关Lea et al,1994；Thomas et al,1988。O型FMDV的表位A和C组成了一个位点，因为它们都临近衣壳结构的G-H环，采用中和性单克隆抗体进行的竞争研究也证明了这一点Parry et al,1990。采用MAR突变体（具有抗单抗中和抗性的毒株）进行交叉中和实验，证实了非连续抗原位点的存在。因为它们不是线性表位，所以线性多肽是无法模拟的。A和O型FMDV的非连续性抗原表位是由源自不同衣壳蛋白的氨基酸残基组成的Baxt et al,1989；Kitson et al,1990；Pfaff et al,1988；Thomas et al,1988。这些抗原位点位于彼此相邻的裸露区域，靠近衣壳的三重对称轴。C型FMDV的非连续性抗原表位D是由位于VP1的C端、VP3的B-B结节和VP2的B-C环的氨基酸残基组成Lea et al,1994。在小核糖核酸病毒中，当环境pH值低于中性时，FMDV衣壳具有独特的不稳定性Brown,1972。FMDV这种对酸的高度敏感性被认为是由于在五聚体界面存在一簇组氨酸的缘故Curry et al,1995。宿主细胞间相互作用FMDV与宿主细胞受体间的相互作用是病毒感染的先决条件。早期试验表明，FMDV粒子经胰蛋白酶温和处理后不仅会丧失感染性而且也不能与组织培养细胞发生结合Cavanagh et al,1977，含有VP1蛋白G-H环上RGD基序的多肽也会抑制FMDV黏附到细胞上Fox et al,1989。进一步的结构和功能研究表明，RGD基序参与病毒与不同的v整联蛋白的相互作用Baxt,2004。虽然RGD基序是一个重要的抗原表位的组成部分，但是它在FMDV田间分离株中高度保守，这意味着当病毒与细胞受体发生相互作用时需要RGD序列Duque and Baxt,2003；Neff et al,1998。从携带有突变RGD基序的感染性克隆中获取RNA，由此构建出的病毒不能诱发易感动物发病也证明了这一点Mason et al,1994。在细胞里单独表达人或牛的v整联蛋白并不能使FMDV发生入侵和感染，利用该手段研究确定了可被用于启动FMDV感染的分子。在体内具有感染性的病毒可以通过整联蛋白v3、v6、v8侵入人工培养细胞Jackson et al,2004；Jackson et al,2000；Neff et al,1998。整联蛋白v6在上皮细胞持续表达，该些上皮细胞是FMDV攻击牛体的靶点。因此，整联蛋白v6被认为是FMDV的主要体内受体Monaghan et al,2005。一旦细胞生长起来，通过对位于三个主要衣壳蛋白结合处浅凹里的氨基酸进行选择性替换，FMDV就可以通过硫酸肝素获得启动病毒感染的能力 Fry et al,1999。FMDV在细胞内增殖几代以后，RGD基序就成为非必需序列，这与衣壳表面氨基酸发生了替换，以及病毒选择了其他的入侵细胞受体有关Baranowski et al,2001;Baranowski et al,2000。在猪体内已经发现了能够与携带赖氨酸-甘氨酸-谷氨酸（KGE）序列而不是RGD基序的基因工程病毒相结合的另外一个细胞位点Zhao et al,2003。采用构成性表达了或者转染了人整合蛋白v6的细胞系，研究分析了FMDV与受体结合后开始早期内化的过程。在两种情况下，借助衣壳特异性单克隆抗体的荧光显微镜法追踪病毒颗粒，再结合内吞途径抑制剂对病毒入侵和感染影响的分析，结果表明O型和A型FMDV主要利用网格蛋白依赖性机制实现病毒的内化Berryman et al,2005；ODonnell et al,2005。AP180是组装网格蛋白笼所必需的，表达了负显性形式AP180的细胞不能被病毒感染也证明了此观点Berryman et al,2005。病毒被细胞快速摄入后，与早期和再循环内体标识分子发生了共定位，而不与溶酶体发生共定位。同样，诺考达唑（nocodazole）不能抑制FMDV感染，病毒最终转运至溶酶体内。诺考达唑是一种抑制膜泡在早期和晚期内体之间进行转运的制剂。有病毒侵入时，整联蛋白v6还被发现聚集在早期和再循环内体上，这表明v6不仅可以作为病毒的黏附受体还可以将病毒转运到酸性内体上Berryman et al,2005。其他小核糖核酸病毒，例如PV，每个非结构蛋白以及大部分前体蛋白都在RNA复制、病毒粒子形成和病毒致病过程中发挥多种作用Andino et al,1999；Choe et al,2005；Whitton et al,2005。宿主细胞膜重排产生多孔结构，进而基因组RNA在此进行复制Bienz et al,1987，非结构蛋白2B、2BC、2C和3A参与和细胞膜的这些相互作用Aldabe and Carrasco,1995；Cho et al,1994；Towner et al,1996。与其他小核糖核酸病毒相比较，FMDV感染细胞的膜重排存在一些不同，例如对布雷菲德菌素A（brefeldin A）不敏感ODonnell et al,2001。布雷菲德菌素A是一种能够抑制由高尔基体衍生的壳蛋白原体Ⅰ[Golgi-derived coat protomer ⅠCOPⅠ]覆盖的囊泡形成的药物，该药物还能够破坏高尔基体复合物。也有报道称，在电子显微镜下可看到在细胞的一侧出现了细胞器坍塌现象Monaghan et al,2004。在FMDV复制位点产生的膜的来源还不清楚Knox et al,2005。利用共聚焦显微镜发现，在被病毒感染的细胞系出现了Golgi-stacks标记物p58与3A和2C蛋白的部分共定位，也出现了钙网蛋白（一种内质网ER的标记物）与3A的部分共定位Garcia-Briones et al,2006；ODonnell et al,2001。与其他小核糖核酸病毒一样，3Dpol含有一个核定位基序，在被FMDV感染的细胞核里还发现了3CD和3Dpol，这表明3CD前体蛋白可以调节蛋白酶3C的核定位，推测可能参与感染细胞的核重组。现在已经广泛采用病毒蛋白在细胞内的瞬时表达方法，详细分析不同的非结构蛋白的功能。在PV及柯萨奇病毒中，3A蛋白负责抑制内质网ER和高尔基体之间的顺行性运输（Doedens at al,1997），从而调控减少蛋白的分泌，例如主要组织相容性复合物MHCI类分子Choe et al,2005，在小核糖核酸病毒感染时被发现了该现象Deitz et al,2000；Sanz-Parra et al,1998。这种机制有助于病毒躲避宿主的免疫系统。在病毒感染细胞后，提取培养液中的膜物质，结果发现FMDV的2B、2C和3A蛋白存在于这些膜粗提物中Moffat et al,2005。与其他小核糖核酸病毒不同的是，在Vero细胞中瞬时表达FMDV 2BC,而不是3A，能够抑制宿主蛋白的分泌。根据免疫荧光分析结果表明，瞬时表达3A没有诱导细胞内膜的大幅度重排Garcia-Briones et al,2006；ODonnell et al,2001，被表达的蛋白分布在小囊泡上Moffat et al,2005；ODonnell et al,2001。在依次加入3B编码区后，3AB产物会发生重新定位，而且会变得越来越紧凑，越来越纤维化Garcia-Briones et al,2006；这种现象与FMDV感染的相关性还有待确定。体内致病机理关于能够决定FMDV感染宿主范围和体内毒力的有关因素的研究资料依然很有限Baxt,2004；Mason et al,2003。感染FMDV会导致野生或家养偶蹄动物出现相似的临床症状，引起急性系统性水疱病，主要特征是发热、口腔和上呼吸道的上皮组织出现水疱性病变（Donaldson,2004）。对FMDV和其他具有高度变异性及强适应性的RNA病毒研究资料Domingo et al.,2003；Domingo,2004表明，病毒与不同宿主的相互作用会引起一个复杂的动态变化。不同的选择压力，例如在不同的靶组织中需要不同的细胞受体启动感染、以最少量复制就可以满足病毒传代的需求及逃避宿主免疫反应等，都会驱使病毒和宿主发生复杂的动态改变。实际上，一旦接触了FMDV，那些没有被感染过也没有被免疫过的反刍动物和那些没有被感染过但是被免疫了动物，都能形成无症状的持续感染，可以从感染后几周甚至是几年的动物的上呼吸道分离出病毒。目前病毒持续性感染机制尚不清楚，但很可能是宿主免疫反应和在上呼吸道黏膜发生抗原变异的病毒之间的动态平衡的结果Salt,1993。如上所述，VP1上的RGD序列与细胞整合素间的相互作用是病毒入侵的必不可少的关键过程。整合素在各种组织和物种中表达，甚至在那些被认定为FMDV非易感性的组织或者物种中也有表达。因而，还有其他的宿主因素决定着FMDV的毒力和宿主感染范围。有趣的是，用整合素结合位点去中和抗体的方法揭示了FMDV抗原性和受体使用可能存在着共同进化Baranowski et al,2001；Baranowski et al,2000。RGD基序和其附近的氨基酸对FMDV与一些RGD-依赖性整合素的结合至关重要。采用合成肽免疫牛后，出现了一些C型FMDV突变株，并发现其中一些突变株的RGD基序或者附近的氨基酸发生了置换现象，例如RGD基序R141G或临近位点L144P和L147P（L代表亮氨酸，P代表脯氨酸）Taboga et al,1997。当在细胞中培养这些变异毒株时，这些突变会很快回复到原始亲本RGD序列状态。但是在细胞培养液中加入免疫牛的血清会延迟回复突变，这表明在部分被免疫保护的牛体内存在病毒抗原性和受体使用的共进化Tami et al,2003。通过对从缺失L和3B基因感染性cDNAs克隆中拯救出来的病毒分析，结果表明这些蛋白的完整性是病毒保持在自然宿主体内完整毒力所必需的。病毒能够适应非天然宿主和自然选择出现了毒力发生改变的FMDV变异株也表明了非结构蛋白影响着病毒毒力和对宿主的嗜性。在鸡胚中连续传代会导致3A蛋白缺失，从而引起了O型和C型FMDV-毒对牛的致病力减弱了Giraudo et al,1990。1997年从台湾分离的O型FMDV变异株证明了3A蛋白出现的10个氨基酸缺失以及不同位点的突变导致病毒对牛的致病力减弱了Beard and Mason,2000。有趣的是，该毒株却对猪的致病力增强了，这表明种属特异性与FMDV毒力有关，宿主和病毒之间的复杂相互作用决定了感染后临床症状和损伤的严重程度。C型FMDV的豚鼠适应性分子机制分析结果也证明了3A蛋白对病毒宿主范围的影响。使豚鼠出现发热和水疱的毒株在2C、3A和VP1出现了单一的氨基酸置换。携带有这些突变点的重组病毒的研究结果表明，3A蛋白上单一氨基酸的置换足以能引起豚鼠出现病症Nunez et al,2001。不同小核糖核酸病毒蛋白的表达可以调控导致细胞发生死亡的凋亡平衡Buenz and Howe,2006。促凋亡和抗凋亡效应间的平衡与病毒细胞间的相互作用有关，更与可持续性感染发生有关。对FMDV来讲，表达了VP1衣壳蛋白的细胞中就出现了促凋亡现象Peng et al,2004。FMDV感染或疫苗免疫会在宿主体内诱导特异性B细胞和T淋巴细胞反应，产生中和抗体，而且中和抗体水平与产生的保护性有关reviewed in Collen,1994；Doel,2005；McCullough,2004。猪只感染FMDV后，会先出现一过性白细胞减少，主要影响CD8 细胞，之后会出现上述反应Diaz-San Segundo et al,2006。FMDV可以通过FC受体介导的吸附作用感染源自巨噬细胞的细胞系Baxt and Mason,1995，这被认为是病毒发生系统性传播的一种机制Rigden et al,2002。FMDV对干扰素非常敏感，干扰素参与了宿主早期抵抗病毒感染的防御机制Chinsangaram et al,2001。FMDV疫苗免疫及其控制疾病的效果不属于本章的介绍范围。目前的FMDV疫苗是采用化学法灭活的病毒制备的Barteling,2004；Doel,2003。即使这些疫苗已经被证明确实有效，但是因为无口蹄疫国家在暴发口蹄疫时很难根据血清学实验区分是感染还是常规疫苗免疫，所以对这些灭活疫苗的使用仍然是一个有争议性的话题Sobrino and Domingo,2001。后来，通过检测3AB非结构蛋白抗体可以区分病毒感染和疫苗免疫，所以，又重新考虑了疫苗的紧急接种防疫Mackay,1998。FMDV田间毒株（7种血清型，每个血清型都有很广的抗原和免疫原谱）基因和抗原的多样性使选择疫苗变得很棘手，但是同时也促进了根据不同RNA区段的核苷酸序列分析建立起来的分子流行病学的发展Knowles and Samuel,2003，这种情况也促使了寻找新的免疫原和新的疫苗免疫策略Grubman,2005；Rowlands,2004；Sobrino et al,2001）。基于RNA干扰的抗病毒方法研究也取得了一些结果。针对FMDV RNA高度保守的2B非结构蛋白编码区设计的短发卡样RNA，与对照组细胞相比较，能够明显减少猪源细胞的病毒RNA和蛋白质合成，并有效降低病毒产量de los Santos et al,2005。此抗病毒效果不是由于诱导了干扰素的抗病毒途径实现的，该方法具有序列特异性，而且对多个血清型都有效果。因而，RNA干扰有可能成为一个可以控制FMD该烈性传染病在家畜中传播的有效方法。致谢本工作得到了BFU-2005-00948、BIO2005-07592-C02-01和CSD2006-0007基金资助，也得到了Fundacin Ramn Areces所基金的大力支持。
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